中藥材中多真菌毒素檢測方法摘要

來自《2351 真菌毒素測定法-2020版藥典》

本法適用于藥材、飲片及中藥制劑中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素、伏馬毒素B1、B2及T-2毒素的測定。

1、 儀器分析方法：

1-1  HPLC法（液相色譜法），采用柱后衍生法，碘衍生法或光化學衍生法，測試黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮共4類

1-2  LC-MS/MS法（液相色譜-串聯質譜法），測試全部種類及多種真菌毒素同時分析

1-3  ELISA法（酶聯免疫法），僅測試黃曲霉毒素類

2、 前處理方法

2-1前處理方法（適用于HPLC法和LC-MS/MS法）

舉例（測試黃曲霉毒素）：取供試品粉末約15g（過二號篩），精密稱定，置于均質瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min），離心5分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液20ml，通過免疫親合柱，流速每分鐘3ml，用水20ml洗脫（必要時可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫，再用水10ml洗脫），棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續濾液，即得。

前處理方法中，一是稱樣量多達15-20g，有些中藥材比較珍貴，成本較高；

二是采用免疫親和法進行前處理，操作步驟復雜，柱子儲運使用條件需要保持低溫。

三是每種真菌毒素對應一種免疫親和柱和一種儀器分析條件，測試多種真菌毒素時，成本很高，而且效率較低。

一般基于這三種原因，實驗員查找其他的前處理方法。

2-2 前處理方法（適用于ELISA法）

稱取供試品粉末約2.0g至50ml離心管中，加入20ml甲醇，振蕩5分鐘，室溫（20～25℃）下以每分鐘3000轉離心5分鐘，取2ml上清液至10ml干凈離心管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干，加入2ml去離子水渦動30秒，再加入6ml三LV甲烷振蕩2分鐘，室溫下以每分鐘3000轉離心5分鐘，取下層三LV甲烷液3ml至10ml離心管中，置氮吹儀上于50～60℃水浴濃縮至干，加入1ml正己烷渦旋30秒，再加入2ml磷酸鹽緩沖液渦旋1分鐘，室溫下以每分鐘3000轉離心5分鐘，取下層液，即得。

前處理方法中，兩次濃縮轉溶操作，容易影響結果平行性，氮吹濃縮的效率相對低。

2-3前處理方法（適用于展青霉素，LC-MS/MS分析）

供試品溶液的制備  取供試品粉末約4g（過二號篩），精密稱定，置于均質瓶中，加水20ml和果膠酶（活性大于1500IU/g）75μl，混勻，40℃下放置2小時，精密加入乙腈60ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min），離心10分鐘（離心速度4000r/min），取上清液20ml，加入無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4：1）混合粉末3g，充分振搖2分鐘，離心10分鐘（離心速度4000r/min），取上清液8ml，通過展青霉素固相凈化柱，收集凈化液，混勻，精密量取5ml（相當于0.3g樣品），置玻璃試管中，40℃條件下用氮氣吹至近干，加2%乙腈溶液（用乙酸調節pH值至2）定容至0.5ml，渦旋2分鐘使混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續濾液，即得。

前處理方法中加入酶，并且在40℃下放置了2小時，采用展青霉素專用固相萃取柱做前處理，此方法只做展青霉素，比其他采用免疫親和柱凈化的前處理方法略微簡化。

2-4 前處理方法（適用于10種真菌毒素，LC-MSMS分析）

測定藥材、飲片及中藥制劑中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、B2及T-2毒素。

取供試品粉末約5g（過二號篩），精密稱定，精密加入70%甲醇溶液50ml，超聲處理30分鐘，離心，精密量取上清液10ml，用水稀釋至20ml，搖勻。精密量取3ml，緩慢通過已經處理好的HLB柱［規格：3ml(60mg)，依次用甲醇和水各3ml洗脫］，直至有適量空氣通過，收集洗脫液；隨后用3ml甲醇洗脫，收集洗脫液，合并兩次洗脫液，于40℃氮氣緩慢吹至近干，加50%乙腈溶液定容至1ml，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，取續濾液，即得。

前處理方法中采用了多功能固相萃取柱，經過活化平衡淋洗洗脫步驟后，上機到LC-MSMS分析，“方法六適用于樣品中多種真菌毒素的篩查測定，實際操作中如果遇到毒素有檢出，但樣品中監測離子對峰面積比與對照品的監測離子對峰面積比不一致時，建議選用其他監測離子對重新進樣確證或選用其他檢測方法進行判定。"

3、 小結

3-1 酶聯免疫法（ELIS法）僅測試黃曲霉毒素類，其他的真菌毒素不在其中；

3-2 HPLC法測試4類，每類真菌毒素對應一種前處理方法和儀器分析方法；

3-3 LC-MS/MS法可以單獨測試某種真菌毒素，也可以一次進樣檢測多種真菌毒素，分析結果用于篩查還是定量分析，取決于方法驗證的數據是否符合定量分析的要求。

3-4 LC-MS/MS法的前處理方法引入了固相萃取法凈化，一次前處理操作、一次進針分析10種真菌毒素，這為提高效率、節約時間人力物力成本指明了優化方向。

3-5 基于LC-MS/MS法，FaTEx-gen固相萃取柱不用活化平衡、淋洗洗脫，樣品萃取溶液一步通過SPE柱后，填料保留雜質，即得目標物上機分析。

4、 FaTEx-gen多真菌毒素一步法凈化柱操作步驟（10多種真菌毒素）

稱取2g樣品，添加一定體積的酸化乙腈溶液，震蕩30min，離心10分鐘，取一定體積的上清液加入FaTEx-gen，以每秒1滴的速度流出，氮吹轉溶后上機到LC-MS/MS分析。

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